KIMIA ANALISA KROMATOGRAFI

Kromatografi  adalah suatu teknik pemisahan , pertama kali  dipakai untuk memisahkan zat warna tanaman.

PRINSIP: Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasisifat sifat fisik dari zat atau molekul yang menyusun suatu campuran.

 Sifat sifat fisik tersebut khususnya:

-          - Kecenderungan suatu zat/ molekul untuk larut dalam  cairan (kelarutan)

-         -  Kecenderungan suatu zat/ molekul untuk bertaut  dengan suatu serbuk bahan padat(absorbsi)

-        -   Kecenderungan suatu molekul untuk menguap.

Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu fasa tetap dan fasa bergerak. Pemisahan pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa ini, sehingga cara- cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi SERAPAN, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi PARTISI.

Dalam pemilihan kromatografi dengan prinsip partisi dan absorbsi ditentukan

tiga faktor:

1.      Mudah tidaknya jenis kromatografi tersebut dipakai untuk menjalankan eksperimen yang dikehendaki.

2.      Maksud dari pemisahan.

3.      Bentuk dari senyawa yang dipisahkan.

Kromatografi dengan prinsip absorbsi umumnya lebih mudah dilaksanakan, karena polaritas absorbennya tetap sehingga pemisahan dapat dilaksanakan dengan manipulasi polaritas pelarutnya. Secara  singkat perbedaan proses absorbsi dan partisi sebagai berikut:

-          Terjadinya partisi sangat tergantung dari daya larut suatu zat dalam suatu pelarut. Berat molekul besar pengaruhnya terhadap proses partisi. Proses absorbsi dipengaruhi oleh bentuk stereometrik suatu zat dan kemampuan permukaan absorben untuk mengakomodasi solut.

-          Pada partisi kedua fasenya lebih sukar larut (diatur), konstan polaritasnya. Pada absorbansi, absorben mempunyai polaritas konstan, sedang pelarutnya dapat diatur polaritasnya sesuai dengan kebutuhan

-           Kromatografi absorbsi dapat dipakai untuk pemisahan dalam kuantitas yang   lebih besar, misal untuk preparatif yang bersifat kuantitatif. Kromatografi partisi baik untuk pemisahan solut yang sangat serupa sifatnya. Mempunyai  daya pisah yang lebih baik tetapi bersifat kualitatif.

-          Kromatografi absorbsi untuk pemisahan senyawa yang kurang polar, seperti hidrokarbon.Kromatografi partisi untuk pemisahan senyawa yang  bersifat lebih polar, seperti karbohidrat dan asam asam amino.

Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography, TLC)

TLC dapat digunakan untuk keperluan yang luas dalam pemisahan. Disamping memberikan hasil pemisahan yang lebih baik, juga membutuhkan waktu yang lebih cepat.

Teknik standard dalam melaksanakan pemisahan dengan TLC adalah:

Petama kali lapisan tipis absorben dibuat pada permukaan plat kaca atau plat   lain.  Tebal lapisan absorben dapat bervariasi , tergantung penggunaannya.

-          Larutan campuran senyawa yang akan dipisahkan diteteskan pada kira 1,5 cm dari bagian bawah plat tersebut dengan menggunakan pipet mikro.

-           Zat pelarut yang terdapat pada sampel yang diteteskan tersebut kemudian diuapkan.

-           Selanjutnya plat kromatografi tersebut dikembangkan dengan mencelupkannya pada tanki yang berisi campuran zat pelarut.

-          Tinggi permukaan zat pelarut dalam tanki  harus lebih rendah dari letak tetesan sampel pada plat kromatografi (kurang dari 1,5 cm).

Dengan pengembangan tersebut masing masing  komponen senyawa dalam sampel akan bergerak keatas dengan kecepatan yang berbeda.

PENYERAP.

Dua sifat yang penting dari penyerap adalah:

 - Besarnya partikel

 - Homogenitasnya.

Besar partikel yang biasa digunakan 1 – 25 mikron. Partikel yang kasar tidak memberikan hasil yang maksimal. Pada TLC butiran yang halus memberikan aliran Pelarut yang lebih cepat.

Beberapa contoh penyerap yang biasa dipakai pada TLC antara lain:

# Silika Gel.

    Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat (binder), untuk memberikan kekuatan pada lapisan, dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kalsium sulfat, dalam perdagangan diberi kode silika gel G.

# Alumina.

    Alumina tak begitu banyak digunakan dalam TLC. Alumina juga diberi  pengikat, alumina yang ada di perdagangan bersifat netral atau basa.

PEMBUATAN LAPIS TIPIS

Untuk pemisahan secara kualitatif yang cepat  dan sering digunakan gelasmikroskop, yang penting bahwa permukaan dari plat harus rata. Plat kaca sebelum dipakai dicuci dulu dengan air dan sabun kemudian dikeringkan. Pencucian terakhir dengan memakai aseton. Jangan menyentuh permukaan dari plat yang telah bersih dengan jari jari.

Langkah pertama adalah: membuat penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerap dan 2 x ml air. Bubur diadauk dan dibentangkan diatas plat kaca dengan berbagai cara. Tebal lapisan merupakan faktor paling penting dalam TLC. Tebal standard adalah 250 Mikron. Setelah penbentangan plat dibiarkan kering selama kira kira 5 – 10 menit. Penyentuhan permukaan dengan jari jari akan merusak lapisan dan akan melepaskan partikel partikel dari permukaan.

FASA BERGERAK  dan PENEMPATAN CUPLIKAN

Fasa bergerak yang digunakan sebaiknya campuran pelarut organik yangmempunyai polaritas serendah mungkin. Campuran yang baik memberikan fasa fasa bergerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya jangan mencampur lebih dari  dua komponen. Karena campuran yang lebih complek cepat mengalami perubahan fasa terhadap perubahan suhu.

CARA MENEMPATKAN CUPLIKAN.

Pada TLC cara menempatkan  sampel atau cuplikan dengan menggunakan pipet mikro atau pipa kapiler. Pada penempatan cuplikan ujung penetes jangan mengenai permukaan lapisan, namun harus diusahakan sedekat mungkin. Pelarut cuplikan harus merupakan pelarut yang mudah menguap dan  mempunyai polaritas yang rendah.Kedudukan noda tidak boleh diberi tanda dengan pensil. Penempatan noda diatas plat ± 1cm dari salah satu ujungnya, dimana ujung ini nanti dicelupkan dalam pelarut. Jangan terlalu lama mencelupkan plat dalam bejana,  bila permukaan pelarut telah mencapai garis akhir karena pengaruh difusi dan penguapan dapat menyebabkan pemancaran dari noda yang terpisah.

PENGEMBANGAN TLC dan LOKASI.

Bila plat TLC telah siap dan cuplikan ditempatkan diatasnya, maka ia  dimasukkan dalam bejana dengan ujung yang paling bawah dimana cuplikan ditempatkan, lalu di celupkan dalam fasa  bergerak yang telah dipilih sedalam ± 0,5 cm – 1,0 cm. Untuk plat kecil (mikroskop slide) sebagai bejana dapat dipakai beker glas  yang kapasitas 100 – 250 ml  dan dinding sebelah dalamnya dilapisi kertas saring yang ujungnya dicelupkan dalam fasa bergerak. Permukaan pelarut yang terdapat didalam bejana jangan sampai berhubungan dengan atmosfir luar, karena mengakibatkan komponen komponen yang mudah menguap lepas oleh penguapan. Setelah pengembangan plat diambil dari bejana dan dibiarkan kering tanpa pemanasan.

LOKASI

Pereaksi lokasi yang umum adalah: yod.

Plat kaca yang mengandung noda noda dibiarkan terkena uap yod, yaitu dengan jalan melatakkan plat dalam bejana yang terttutup berisi kristal yod untuk beberapa saat. Untuk senyawa tak jenuh akan memberikan noda yang tak berwarna. Untuk senyawa organik yang jenuh akan menimbulkan noda yang berwarna coklat.

IDENTIFIKASI dan HARGA Rf

Identifikasi dari senyawa senyawa yang terpisah pada TLC lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia. Biasanya untuk identifikasi menggunakan harga Rf (retordation factor).

                      jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal.

Harga Rf = __________________________________________

                      jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal.

Pengukuran yang sering dipakai lainnya adalah Rx atau Rstd yaitu:

                               jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui.

Rx atau R std = _________________________________________________

                           jarak yang digerakkan oleh senyawa standard yg diketahui.

Senyawa standard biasanya memiliki sifat sifat kimia yang mirip dengan senyawa yang  dipisahkan pada kromatogram. Faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam TLC dan juga  mempengaruhi harga Rf:

-          Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

-          Sifat penyerap dan derajad aktifitasnya.

-          Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

-          Pelarut dan derajad kemurniaan fasa bergerak.

-          Derajad kejenuhan dari uap dalam  bejana pengembang yang digunakan.

-          Jumlah cuplikan yang digunakan.

-          Suhu.

-          Keseimbangan.

-          Teknik percobaan.

PERBANDINGAN TLC DENGAN KROMATOGRAFI LAIN.

TLC perlu dibandingkan dengan krpmatografi kolom serapan, karena  mempunyai sistem fisika yang bersamaan; TLC juga perlu dibandingkan  dengan kromatografi kertas,  karena mempunyai kesamaan dalam teknik  eksperimennya.

1.      Kromatografi kolom merupakan proses yang lambat. Membutuhkan  penyerap relatif  dalam jumlah besar, demikian pula cuplikan yang digunakan di dalam eksperimen sukar    melokasir senyawa senyawa dalam kolom. TLC hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam  jumlah yang sedikit dan noda noda  yang terpisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembaran kertas. Setelah pemisahan  mudah diperoleh  senyawa senyawa yang terpisah secara individu.

2.      TLC mempunyai keuntungan yang utama yaitu membutuhkan waktu yang  lebih cepat dan diperoleh pemisahan yang lebih baik TLC dapat digunakan untuk pemisahan senyawa senyawa yang bersifat hidrofobi, seperti lipida lipida dan hidrokarbon, dimana hal ini sulit bila dilakukan dengan kromatografi  kertas.